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winner802光子相關(guān)納米粒度儀的應用

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生化診斷是醫院檢驗科最為常見(jiàn)的診斷平臺，具有準確度高、精密度好及試劑性能穩定等特點(diǎn)，而膠乳增強免疫比濁法又是生化診斷平臺中運用最為廣泛的一種方法，能大大提高生化檢驗的分析靈敏度，在臨床診斷中得到了廣泛的運用。

膠乳致敏顆粒的制備過(guò)程如下：將抗體與聚苯乙烯納米羧基微球在特定的緩沖液中孵育，加入一定量羧基活化劑，使得IgG分子N-端的氨基與微球表面的羧基發(fā)生共價(jià)偶聯(lián)，形成牢固的酰胺鍵，最終微球表面被包被了一層IgG，可與人血清樣本中相應的抗原發(fā)生抗原抗體反應而致敏。然而在包被抗體過(guò)程中，由于所處緩沖體系的變化、包被IgG等電點(diǎn)與Buffer PH相近等原因，微球表面原先的電荷平衡會(huì )被打破，導致納米微球粒子之間會(huì )發(fā)生一些可逆性的聚集，使得納米微球粒徑增大為裸球的幾倍甚至數十倍，直至微球聚集沉淀。同時(shí)，由于顆粒之間的聚集程度不一致，導致整個(gè)膠體溶液體系的均一性很差，分散度不好。

粒徑增大及分散度變差的膠乳致敏顆粒會(huì )嚴重影響試劑的性能，如靈敏度降低、線(xiàn)性范圍變窄及穩定性變差等。這時(shí)，除了選擇合適的膠乳儲存液之外，我們還需要用超聲波細胞破碎機將團聚的膠乳顆粒用超聲波打散并實(shí)時(shí)監測其粒徑及分散指數的變化，直至其下降到能滿(mǎn)足試劑相應的性能指標要求為止。然而，如果超聲能量過(guò)大或者時(shí)間過(guò)長(cháng)，雖然能使微球粒徑及分散指數降至很低的水平甚至接近裸球的水平，但是超聲波的高能量會(huì )對微球表面包被的IgG分子有一定的破壞，使得致敏膠乳顆粒失效。綜上所述，我們在超聲過(guò)程中需要不斷監測膠乳顆粒粒徑及分散指數的變化，找到一個(gè)合適的范圍，既能保證試劑的各項性能指標要求，又能及時(shí)終止超聲過(guò)程以減少其對IgG分子的破壞，保證抗體的生物活性。

本研究以人血清肌紅蛋白檢測用致敏膠乳顆粒的制備過(guò)程為例，通過(guò)大量實(shí)驗數據闡明在膠乳顆粒制備過(guò)程中粒徑及分散指數的控制對最終試劑性能的影響。

本研究中用到的主要原料及儀器如下：

原料及儀器名稱(chēng)

廠(chǎng)家

規格/批號/型號

羊抗人肌紅蛋白多克隆抗體

北京阿匹斯生物生物技術(shù)有限公司

批號：20160506

聚苯乙烯羧基納米微球

JSR Life Sciences

規格：P0219

超聲波細胞破碎機

南京先歐儀器制造有限公司

型號：XO-900D

粒徑分析儀

濟南微鈉

型號：Winner 802

全自動(dòng)生化分析儀

長(cháng)春迪瑞

CS-1200

 

本研究的實(shí)驗方法如下：將制備好的人血清肌紅蛋白檢測用致敏膠乳顆粒進(jìn)行冰浴超聲，每隔10min取樣測試粒徑（單位為nm）及分散指數（以粒徑儀測值*10000表示）（粒徑儀事先進(jìn)行校準），實(shí)驗結果如下：

    由上圖可知，隨著(zhù)超聲時(shí)間的延長(cháng)，粒徑及分散度迅速下降，約20min之后達到一個(gè)平臺期，粒徑及分散度下降緩慢。

選取每一個(gè)超聲時(shí)間點(diǎn)的致敏膠乳顆粒，測試試劑線(xiàn)性范圍實(shí)驗結果如下：

從以上實(shí)驗結果可以看出，隨著(zhù)超聲時(shí)間延長(cháng)，致敏膠乳顆粒的粒徑及分散指數逐漸降低，對應試劑的線(xiàn)性范圍逐漸變寬，分析原因如下：當膠乳致敏顆粒粒徑及分散度較大時(shí)，在體系中顆粒聚集在一起，反應梯度不明顯，整體吸光度值都很高；超聲打散膠乳顆粒后，接近單個(gè)粒子的膠乳體系與抗原反應時(shí)能形成很強的濁度，是線(xiàn)性范圍變得很寬，且打散后的膠乳顆?？贵w暴露的更完全，免疫反應很強，吸光度值更高；繼續超聲，雖然粒徑及分散度降的更低，但包被的IgG分子一定程度上被超聲波的高能量所破壞，導致線(xiàn)性范圍變窄，低值靈敏度及高值可報告范圍均變差。

    同樣選取每個(gè)超聲時(shí)間點(diǎn)的致敏膠乳顆粒，測試試劑在37℃熱環(huán)境下的穩定性，測試一個(gè)月，實(shí)驗結果如下：

從以上實(shí)驗結果可以看出，隨著(zhù)超聲波打散的進(jìn)行，致敏膠乳顆粒的粒徑及分散指數逐漸降低，試劑的熱穩定性也呈現出一定的規律：0min及10min兩組由于粒徑過(guò)大，膠乳顆粒直接聚集沉淀，無(wú)法測試穩定性；20min由于膠乳顆粒沒(méi)有處于完全打散狀態(tài)，顆粒會(huì )有逐步緩慢聚集的過(guò)程，穩定性測試表現為上升的趨勢并在28天的時(shí)候聚集沉淀；30minn時(shí)膠乳顆粒的粒徑及分散度處于最佳的水平，試劑性能較為穩定；隨著(zhù)超聲時(shí)間的延長(cháng)，IgG分子的破壞越來(lái)越明顯，導致試劑不穩定。

綜上所述，在致敏膠乳顆粒制備過(guò)程中需要通過(guò)超聲波打散凝集的膠乳，而粒徑及分散指數的監測可以作為衡量超聲效果的很好指標。在本研究中，肌紅蛋白致敏膠乳顆粒制備的最佳超聲時(shí)間是30min，此時(shí)的粒徑為274nm，分散指數為0.0426，此時(shí)的試劑性能最佳。             

然而，不同的項目可能表現為不同的超聲時(shí)間、最佳粒徑及分散指數，但是都會(huì )有以下的規律：致敏膠乳顆粒粒徑及分散指數過(guò)大時(shí)，整個(gè)體系不穩定，膠乳顆?？赡軙?huì )聚沉，試劑性能較差；粒徑及分散指數過(guò)低時(shí)，高強度的超聲波可能會(huì )破壞IgG分子的生物學(xué)結構和功能，從而導致試劑性能變差。所以我們需要通過(guò)超聲控制合理的粒徑及分散指數，使得試劑性能達到一個(gè)最佳狀態(tài)。在每一個(gè)項目的研發(fā)上，我們可能都需要找到致敏膠乳顆粒的最佳粒徑及分散指數，以及時(shí)終止超聲過(guò)程，保證試劑的最佳性能。